研究背景：
心房颤动（AF）是最常见的心律失常疾病，最近研究阐明了心房心肌病（ACM）是房颤发生的原因之一，进而造成心房血栓形成和卒中。然而，心房病变复杂而持久的致病过程仅被实验模型部分复制，其潜在的分子行为和信号通路仍知之甚少。
大型动物（山羊、猪和狗等）是房颤研究的重要模型，这些模型构建通常是快速心房起搏或人工诱导二尖瓣功能不全，成功率较低、花费较高，而鼠的模型构建更节省成本。但小鼠在没有程序化电刺激的情况下通常不会发生房颤，具有自发性房颤的模型需要基因修饰来诱导稳定和可遗传的重构。
启动子中的cAMP响应元件（CRE）与cAMP响应元件蛋白（CREB）和cAMP响应元件调节器（CREM）作为二聚体结合，该二聚体控制下游信号分子的活性，参与转录信号通路。CREM的一种IbΔC-X亚型，Muller教授等人利用TALEN系统开发了一个表达CREMIbΔC-X的转基因小鼠模型。这些转基因小鼠表现出包括心房增大、自发性房颤和左心室肥厚等心脏表型。功能分析显示该模型中心房纤维化、传导系统受损、肌浆网Ca2+渗漏增加。因此，CREM-IbΔC-X是一个合适的靶基因，具有广泛调控功能参与发病机制。
CRISPR/Cas9系统是一种简单、快速的工具，它可以有效地修饰不同物种和细胞类型的内源性基因。本研究的目的是利用CRISPR/Cas9技术生成心脏特异性的CREM-IbΔC-X转基因小鼠（称为CS-CREM小鼠）。
实验结果：
房颤患者心房组织中CREM-IbΔC-X的表达增加
CREM-IbΔC-X是CREM转录因子的一种亚型，是cAMP信号传导的抑制因子。转录组学研究表明，CREM/ATF1家族靶基因的下调与人类AF易感性相关。为了进一步研究CREM-IbΔC-X在房颤患者中的表达水平，获取了窦性心律患者和房颤患者的心房组织。
首先进行免疫荧光染色，检测panCREM蛋白的表达（图1A）。结果表明，房颤患者心房样本中泛CREM蛋白的表达普遍较高。同时检测CREM蛋白及其亚型的表达（图1B）。结果一致显示，与野生型CREM蛋白及其亚型对应的3条主要条带（~37、30和20 kDa）在AF组中更为明显。使用qPCR评估了CREM-IbΔC-X亚型的mRNA水平（图1C）。结果显示，在房颤患者的心房标本中，CREM-IbΔC-X亚型的表达明显增加。
Figure 1.房颤患者心房样本中CREM-IbΔC-X蛋白表达的验证
利用CRISPR/Cas9技术构建CS-CREM小鼠
在本研究中，作者使用CRISPR/Cas9系统在小鼠（称为CS-CREM小鼠）中诱导心脏特异性的CREM-IbΔC-X过表达。
靶向策略如图2A所示，通过CRISPR/Cas9基因编辑，将靶基因成功整合到小鼠H11染色体中。对三种高危sgrna进行了可能的脱靶效应试验，研究表明在CS-CREM小鼠中脱靶效应和随机插入CREM-IbΔC-X在C-CREM小鼠中是不可见的。
野生型和转基因小鼠表现出相同的外观和大小（图2B）。为了鉴定小鼠的基因型，作者使用特异性引物序列扩增DNA，野生型（412 bp）和靶向小鼠（307 bp）产生不同的条带，如图2C所示。
生存分析显示，纯合子小鼠的寿命不到一个月；杂合子小鼠与野生型小鼠之间的生存曲线无统计学差异（P > 0.05，图2D）。5只产后杂合子雌性小鼠中有4只在出生后死亡，高于平均死亡率。可能怀孕增加了心脏负担，导致心力衰竭、产后死亡。因此，将雄性杂合子小鼠与雌性野生型小鼠交配，产生杂合子后代，同时验证了杂合子小鼠的CREM-IbΔC-X基因在子代中稳定表达。
Figure 2. 靶向插入CREM-IbΔC-X并生成CS-CREM小鼠
CS-CREM小鼠的心房电生理重构
本研究的重点主要是杂合子小鼠和野生型小鼠之间的差异。心电图显示，与野生型小鼠相比，杂合子小鼠的p波振幅明显降低，而p波持续时间无统计学差异（图3B-C）。在12周龄时，与野生型小鼠相比，杂合子动物的心房早搏负荷显著增加（P = 0.0128，图3D）。此外，在8周龄时，1只杂合子小鼠在常规心电图检查中发生了房颤，在16周时发生房颤的概率为20%（9/41）。随着小鼠年龄的增长，杂合子CS-CREM小鼠中AF的患病率增加。到28周时，60%（25/41）的杂合子小鼠发生了AF。log-rank 13检验显示，两条无AF生存曲线之间的差异有统计学意义（P < 0.0001，图3E）。
为了进一步探索CS-CREM动物自发性房颤的电生理特性，作者对20周龄野生型（wt）和杂合子（ki/wt）小鼠的心房进行了评估。结果显示，ki/wt小鼠的心房表现出不均匀的电传导，如自发节律和8Hz起搏下的折返（图3F）。传导速度的计算表明，ki/wt小鼠心房电传导速度明显低于年龄匹配的野生型小鼠自发（0.90 ± 0.046mm/s vs. 1.27 ± 0.22mm/s，P = 0.0459）和8Hz（0.71 ± 0.024 mm/s与1.10 ± 0.23mm/s，P = 0.0392）（图3G-H）伴随心房有效不应期的显著延长（图3I，42.733 ± 5.93 ms与30.83 ± 1.04 ms，P = 0.0268）。
Figure 3. CS-CREM小鼠的心房电生理重构
CS-CREM小鼠的心房结构重构
考虑到心房病变可形成房颤的底物，作者利用超声心动图和Masson染色对CS-CREM小鼠的心房结构重构进行进一步的研究。分别在出生后12周、20周和28周进行超声心动图检查。在后两个时间点，与年龄匹配的野生型对照组相比，杂合子CSCREM小鼠显示出明显的心房增大。12周后，野生型小鼠的心房大小并不随年龄的增长而增加。然而，杂合子CS-CREM小鼠的心房大小随着时间的推移逐渐增大（12周vs. 28周，P=为0.0266）。
在同一时间点进行Masson染色，以评估CS-CREM和野生型对照小鼠的心房纤维化（图4A）。杂合子与野生型对照组相比，年龄匹配的CS-CREM小鼠表现出心房纤维化显著增加。此外，杂合子和野生型小鼠在12周和28周之间均表现出心房纤维化的增加趋势，但只有杂合子小鼠具有统计学意义（P < 0.0001，图4D）。与心房重构相反，心室纤维化没有显著性差异，从12-28周，杂合子CS-CREM小鼠的射血分数在50%左右波动，但保持不变。本研究结果提示，衰老可能会促进CS-CREM小鼠的心房纤维化并进行了实验验证。
Figure 4. CS-CREM小鼠的心房结构重构
CS-CREM小鼠的蛋白质组学研究
为了探讨CS-CREM小鼠心房病变的潜在机制，作者进行了蛋白质组学分析。收集28周龄杂合子小鼠（ki/wt，n = 4）和野生型小鼠（wt，n = 4）的心房样本进行蛋白质组学实验。结果显示，共表达了786个不同的蛋白，其中365个蛋白显著上调，421个蛋白显著下调（P值0.05，foldvhange1.5）。蛋白质组学分析显示，与年龄匹配的野生型小鼠相比，CS-CREM小鼠中Myl4和Nppa表达下调。对CS-CREM小鼠中上调基因的分析显示，与病灶粘附和血小板活化相关的基因强烈富集（图5C）。下调基因的富集图谱显示，在CS-CREM小鼠中，有多种受影响的代谢过程，特别是脂肪酸降解和氧化磷酸化代谢（图5D），这与使用来自ACM患者的心房样本进行的宝贵的蛋白质组学研究一致。通过ChIP-qPCR进一步探索了CREM-IbΔC-X可调控的下游基因，发现CREM-IbΔC-X在Myl4和Nppa的启动子区域显著富集（图5E-F）。
Figure 5.CS-CREM和野生型对照小鼠的蛋白质组学分析
CS-CREM小鼠的药物反应
为了评估CS-CREM小鼠模型中对抗心律失常药物的反应，作者使用了胺碘酮（III类）和普罗帕酮（Ic类），参考之前关于动物干预药物剂量的研究。房颤小鼠尾静脉注射5 mg/kg胺碘酮，如图6A所示，胺碘酮有效地为所有模型终止了房颤的发作（5/5），并恢复了持续至少5分钟的窦性心律（图6C-D)。同样，1.5 mg/kg的普罗帕酮（图6B）也成功地终止了CS-CREM小鼠中AF的发作（4/4），并维持了大约5分钟的窦性心律（图6C-D）。总之，CS-CREM小鼠显示出作为体内药物试验的理想AF模型的前景。
Figure 6. 静脉注射胺碘酮和普罗帕酮终止CS-CREM小鼠的AF
结论：
研究通过在小鼠中心脏特异性过表达CREM-IbΔC-X，建立了一个新的ACM模型。CS-CREM小鼠代表了一种稳定、经济、通用的模型，在研究ACM的机制和治疗靶点具有很大前景。
