塑料中的毒素-Di-2-ethylhexylphthalate（DEHP）对心脏有抑制作用

背景：

邻苯二甲酸酯类塑化剂广泛用于消费品和医疗产品制造中，包括气管插管、静脉输液袋、血液储存袋和医疗管道等。其中，Di(2-ethylhexyl) phthalate （DEHP）常被用作塑化剂添加剂，在聚氯乙烯制品中发挥软化和增加柔韧性的作用。由于DEHP与聚氯乙烯之间没有形成共价结合，在与亲脂溶液接触、温度升高或时间延长时，DEHP很容易被溶出。在过去的血库研究中，溶出的DEHP可以减少红细胞溶血并延长保存时间，对血液制品有益。然而，新的研究表明DEHP积累在储存的血液制品中，当无意中接触时，可能会对人体健康造成危害。

流行病学研究显示邻苯二甲酸酯类化学物渗出与心血管疾病死亡风险增加有关。在本实验研究中，我们旨在进一步了解临床邻苯二甲酸酯渗出对心脏的潜在风险。因此，我们首先测量了存储红细胞制品中的DEHP浓度，并将这些浓度作为心脏毒性评估的指导。我们在离体心脏和人诱导多能干细胞衍生心肌细胞中给予DEHP，评估和量化DEHP对心脏电生理指标影响。此外，我们还研究了使用毒蕈碱受体拮抗剂和基质金属蛋白酶抑制剂是否能消除DEHP的心脏毒性效应。

方法：

文中采用MappingLab公司的多通道电极阵列分别贴在左右心房（测量心房传导）、左心房左心室（测量房室传导），使用EMapRecord软件采集电信号，EMapScope进行分析，研究急性给予DEHP后对心脏电生理的直接影响。

结果：

1、DEHP具有负变时性效应，且呈剂量依赖性

DEHP可能会从医用塑料中渗出，导致患者无意中接触到高浓度的DEHP。实验结果显示，在冷藏血液存储过程中，RBC单位中的DEHP浓度逐渐增加，储存7天的浓度为23-34 μg/mL，35-42天的浓度增加到42-119 μg/mL（p<0.05；图1）。以这些浓度为指导，在Langendorff心脏进行量效研究，以评估DEHP对心脏功能的影响。结果显示，当DEHP浓度达到一定水平时，抑制心脏自律性，心率下降；高浓度的DEHP引起心脏节律的异常变化。（图2A）

文中还对窦房结恢复时间（SNRT）进行测量，作为自律性的指标。在control条件下，SNRT保持稳定，急性给低剂量DEHP时也保持稳定。然而，给予高剂量DEHP后，SNRT明显延长，表明窦房结功能受损。部分实验中无法确定SNRT，因为心房起搏未引发心室反应或窦性活动完全消失。这些结果揭示了DEHP对窦房结功能的直接影响。（图2B）

                                                                                                                                                      图1：随着储存时间的增加，冷藏红细胞（RBC）单位中DEHP浓度升高。

                                                                                                                                                                图2：DEHP以剂量依赖的方式减慢窦性心率和恢复时间。

2、DEHP具有负变时性效应，且具有时间依赖性

长时间接触DEHP会对心脏电生理产生明显影响。研究表明，随着给予DEHP时间的延长，窦性频率和心室率逐渐下降，出现房室分离现象。同时心室节律，心率变异性显著增加，窦房结恢复时间延迟。部分实验中无法测量到窦房结恢复时间，因为心房起搏未能引发心室反应或者窦性活动未能恢复。此外，还发现冠状动脉血流明显下降。（图3）

                                                                                                                                                                  图3：DEHP以时间依赖的方式减慢窦性心率和恢复时间。

3、DEHP会延迟心房间、心房心室间的传导。

给予DEHP会延迟心脏传导速度，导致心房间和心房心室间的传导时间延长。使用多通道电极阵列（MEA）和光学标测技术进行测量，发现DEHP使心房激活时间延长三倍，房室传导时间延长两倍。这些结果表明DEHP对心脏电传导产生了明显影响，使心脏传导速度变慢。（图4）

                                                                                                                                                                       图4：给予DEHP会延迟心房间和房室间的传导。

在心电图记录中，给予DEHP后会导致窦性节律下的房室传导减慢。随着给予DEHP时间的延长，PR间期增加。随着时间越长，房室传导延迟可能发展为房室分离或传导阻滞。给予电刺激进一步研究DEHP对房室结功能的影响，在右心房起搏，逐渐增加刺激频率，发现加入DEHP后，较慢起搏频率下更容易导致房室传导阻滞，且Wenckebach cycle length（WBCL）延长。此外，加入DEHP还导致2：1房室传导阻滞的发生频率增加。另外，在加入DEHP后房室结有效不应期（AVNERP）延长，且需要更长的刺激间期才能诱发出心室电活动。（图5）

                                                                                                                                                                         图5：给予DEHP会增加房室传导时间和不应期。

4、给予DEHP会减慢心外膜传导速度，延长动作电位持续时间

之前曾报道DEHP会破坏细胞间的缝隙连接，细胞间缝隙连接的减少可以降低房室传导速度和心外膜传导速度。使用电压敏感染料和高速光学标测，我们观察到，给予DEHP会导致心外膜传导速度减慢，心室动作电位时程（APD）在30%和80%复极阶段均延长。此外，DEHP还延长了心室的有效不应期，但对细胞内钙瞬变30%或80%没有显著影响。（图6）

                                                                                                                                                           图6：给予DEHP会减慢心外膜传导速度并延长动作电位时程。

5、DEHP对心脏电生理的影响不会被毒蕈碱拮抗所消除

先前的研究表明心脏毒蕈碱受体是邻苯二甲酸酯增塑剂的潜在靶点，因为阿托品可以减弱金鱼和人心房肌中邻苯二甲酸酯的心脏抑制作用。实验结果表明，即使在使用阿托品处理的情况下，DEHP对窦性活动和房室传导的影响依然存在。因此，DEHP的作用不能完全通过毒蕈碱受体拮抗来解释（图7）。先前的研究还表明DEHP可以破坏细胞间偶联，并且这种影响可能与基质金属蛋白酶活性的上调有关，该酶调节缝隙连接蛋白并影响心脏的电特性。我们使用基质金属蛋白酶抑制剂doxycycline对心脏进行预处理，发现doxycycline可以部分减轻DEHP对窦性活动的抑制作用，但对房室传导的影响没有改善。

图7：DEHP的作用在一定程度上被基质金属蛋白酶抑制剂缓解，但不受毒蕈碱拮抗作用的影响。

 

6、DEHP在hiPSC-CM单层细胞中减慢传导速度

DEHP已被证明能减少细胞间的缝隙连接，但在某些组织(如肝脏)，这种作用可能是特异性的。为了测试在人心肌细胞上的适用性，我们使用人诱导多能干细胞分化的单层心肌细胞（hiPSC-CM），在微电极阵列上进行了传导速度的测量（以1.5 Hz的频率进行刺激）。结果显示，给予DEHP会以剂量和时间依赖的方式减慢细胞的传导速度。在最初的15分钟内，较低剂量的DEHP对传导速度没有显著影响，而较高剂量的DEHP会导致传导速度下降。随着持续3小时的DEHP处理，细胞的传导速度进一步降低。虽然加入阿托品或doxycycline在最初1小时内可以减轻DEHP对传导速度的影响，但在较长时间的DEHP处理后，细胞的传导速度仍然减慢。（图8）

                                                                                                                                                                       图8：DEHP减慢了hiPSC-CM单层细胞的传导速度。

讨论：

本研究表明，DEHP是一种心脏毒性化学物质，以剂量和时间依赖的方式减慢窦性心率，延迟窦房结恢复时间，并延长房室传导时间，影响心脏功能。DEHP作为医疗塑料增塑剂被长期使用，但是它的使用是存在安全问题的，特别是在输血和医疗过程中，减少含DEHP塑料使用渐渐被人们所关注。本文量化DEHP在血液中的浓度，为无DEHP材料开发提供指导意见。

原文链接：

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.05.22.541729v1