前言
心肌梗死(MI)由于其发病率和死亡率高引发高度关注。研究表明：利用生物材料治疗心肌梗死已取得重大进展，生物材料在构建工程心脏组织(ECTs)和移植后ECTs修复中具有重要意义，生物材料也可作为干细胞载体达到提高治疗效果作用。然而，缺血、缺氧和炎症性MI微环境严重限制了ECTs或干细胞的存活和功能。因此，在生物材料中引入特定的功能基团或生物活性物质，对病变组织的微环境进行智能响应和调控引发关注。如何利用生物材料逆转早期心肌梗死微环境，进一步赋予其促进修复的能力，是提高治疗效果的关键，也是近年来促进心脏修复的生物材料设计研究的重点。
目前，研究人员已使用导电金纳米颗粒(AuNPs)、碳基导电材料、导电聚合物和其他导电纳米材料来改善疤痕组织的导电性和电脉冲。因AuNP具有可控的几何结构、光学及表面特性、低细胞毒性和生物相容性，是修复心肌梗死的理想纳米材料。尽管AuNPs具有导电能力，但心肌梗死微环境中ROS水平过高严重损伤心肌细胞和植入干细胞。而铂（Pt）纳米颗粒具有催化和抗氧化活性，但铂的成本较高。具有树枝状Pt外壳的核壳Au@Pt纳米颗粒(Au@Pt NPs)可减少Pt的使用量，增强清除自由基的能力。
近日，军事医学研究院周瑾教授、王常勇教授和北京化工大学徐福建教授团队在《ACS NANO》发表了题目为：Injectable Hydrogels Encapsulating Dual Functional Au@Pt Core−Shell Nanoparticles Regulate Infarcted Microenvironments and Enhance the Therapeutic Efficacy of Stem Cells through Antioxidant and Electrical Integration的相关研究论文。
此研究中开发了一种具有明显抗氧化功能的天然黑色素/海藻酸盐水凝胶(Au@Pt/Alg)，将Au@Pt/Alg水凝胶加载干细胞，评估其对电整合和心功能的影响。Au@Pt/Alg水凝胶可以通过清除ROS促进心肌细胞和棕色脂肪干细胞(brown adistem cells, BASCs)的存活以及促进BASCs对心肌细胞(CMs)的分化和旁分泌能力。此外，将负载BASCs的Au@Pt/Alg水凝胶注入大鼠心肌梗死区，发现Au@Pt/Alg水凝胶可有效降低ROS水平，提高植入BASCs的保留和存活，诱导血管生成，促进心肌梗死区电传导速度，有效促进心功能恢复。目前的研究是多功能微环境调节生物材料和干细胞移植治疗心肌梗死的尝试，这将为心肌梗死治疗策略的制定提供有价值的信息。
Figure 1. 携带BASCs的Au@Pt/Alg水凝胶制备原理图及在体内心脏修复中的治疗机制示意图
此次研究中采用多通道电生理标测技术检测了不同组心肌梗死的电传导情况，更清晰的展示了Au@Pt/Alg水凝胶在心电功能修复中的效果。
实验结果
Au@Pt NPs图像通过使用表面活性剂辅助工艺和超声照射处理获得。Au@Pt NPs表现出树枝状形态，铂纳米颗粒均匀分布在AuNPs表面，然后将得到的纳米颗粒加入海藻酸钠中，用葡萄糖酸钙诱导海藻酸钠链的交联。结果在10 min内得到了均匀的Au@Pt/Alg水凝胶。Au@Pt在Au@Pt/Alg水凝胶中分散良好，随着Au@Pt NPs浓度的增加，水凝胶的颜色逐渐变暗。在不同浓度的Au@Pt/Alg水凝胶组中，Au@Pt/Alg水凝胶的存储模量(G′)高于损失模量(G″)。G’值范围为380 ~ 600pa，提供机械强度有助于MI修复。
研究显示：水凝胶可能更有利于机械信号的传递，从而使心脏组织搏动更加协调。Au@Pt/Alg水凝胶表面粗糙，有利于心肌梗死区域细胞的粘附，进一步促进心肌梗死的修复。Au@Pt NPs能有效提高Alg水凝胶的导电性，此外，Au@Pt/Alg水凝胶的导电性与天然心肌的导电性相似，在促进心肌梗死区域导电方面具有明显的优势。
将Au@Pt NPs与天然Alg水凝胶结合，提高水凝胶的导电性，有效模拟天然心脏组织的导电性微环境。这些结果为后续心肌梗死区电传导和电整合的促进以及心脏再生的最终目标奠定了基础。
此外，研究表明，Au@Pt NPs能有效催化H2O2生成H2O和O2，从而实现抗氧化功能。Au@Pt NPs的抗氧化性主要来自于铂沉积在金表面的电子结构和高催化性能，这是清除ROS的主要原因。这有利于去除MI区有害的羟基自由基、H2O2等ROS，从而达到重塑MI微环境的目的。
Figure 2. Au@Pt/Alg水凝胶的制备与表征
Au@Pt NPs在ROS微环境中对CMs和巨噬细胞的作用
研究发现：Au@Pt NPs可以保护CMs免受ROS损伤，增强Cx43的表达。采用多电极阵列(MEA，MappingLab，UK)检测了Au@Pt NPs下CMs的电脉冲放电区域频率和场电位。加入Au@Pt NPs后，CMs产生的区域场电位振幅及其动作电位频率均大于正常培养下的CMs。更有趣的是，加入Au@Pt NPs还可以提高ROS微环境下CMs的场电位振幅和动作电位频率，表明Au@Pt NPs可以增强电脉冲的传播。在本研究中，通过MEA检测了CMs在细胞水平上的电化学性能，这与导电性纳米材料可以促进CMs的同步收缩和电传播的报道一致。
心肌梗死早期的氧化应激和炎症激活是心肌梗死发生的关键机制，当原代免疫细胞浸润梗死心肌时，巨噬细胞分泌并释放大量炎症因子，这进一步加剧了心肌损伤。一系列研究表明，Au@Pt NPs可以将H2O2分解为H2O和O2，这可能是Au@Pt NPs抗氧化和减轻炎症的主要因素。此外，通过QPCR检测BMDMs中炎症相关基因(肿瘤坏死因子α (TNF-α)、C−C模式趋化因子配体2 (CCL-2)、促炎诱导型一氧化氮合酶(iNOS))的表达。结果表明，Au@Pt NPs可有效降低H2O2诱导的炎症反应，且促炎基因表达显著降低。在此过程中，抗炎因子(转化生长因子β (TGF-α)、Arginase1 (Arg1)、IL-10)的表达没有明显变化。
图3. Au@Pt对ROS微环境中CMs和巨噬细胞的影响
BASCs在Au@Pt/Alg水凝胶中的存活和分化
检测了Au@Pt/Alg水凝胶携带BASCs的效果。首先，使用阿拉玛蓝溶液评估Au@Pt/Alg(0、0.2、0.5、1和2 mg/mL)对培养3、7和14天的BASCs活性的影响。Au@Pt/ Alg水凝胶(2 mg/mL)对BASCs活性有明显抑制作用。3D成像显示，即使在Au@ Pt/Alg水凝胶中，BASCs也有分布，因此进一步研究了在H2O2诱导的氧化应激下，Au@ Pt/Alg水凝胶中BASCs的活性。通过免疫荧光染色实验证实了Au@Pt的加入促进了水凝胶中BASCs向CMs分化，同时，在ROS微环境中Au@Pt/Alg水凝胶中的BASCs向CMs分化增强。这可能与Au@Pt的抗氧化功能有关，它可以通过清除H2O2诱导Au@Pt/Alg水凝胶中的BASCs向CMs分化。
Au@Pt/Alg水凝胶可以通过有效去除ROS来提高BASCs的活力。Au@Pt/Alg水凝胶能有效促进ROS环境下BASCs的旁分泌水平。通过实验证实了Au@Pt/Alg水凝胶携带BASCs不仅能有效促进BASCs在ROS环境中的存活，还能促进BASCs的分化和旁分泌，为后续使用Au@Pt/Alg水凝胶治疗MI提供了理论依据。
Figure 4. Au@Pt/Alg水凝胶对BASCs的影响
MI区域携带BASCs的Au@Pt/Alg水凝胶的抗氧化、抗炎和血管生成
相关结果证明1 mg/mL Au@Pt/Alg具有良好的生物相容性。此外，受体外实验结果和生物相容性结果的鼓舞，对不同阶段的抗氧化、抗炎、心肌修复和血管生成进行了研究。
研究结果显示，CMs在Au@Pt/Alg水凝胶中存活。Cx43的高表达表明Au@Pt/Alg水凝胶组间隙连接重构，这对心脏修复至关重要。此外，携带BASCs的Au@Pt/Alg水凝胶组梗死区也可见明显水平条纹结构的心肌细胞，这可能是心肌梗死区移植的BASCs分化产生的CM。
心肌梗死发生时，血管新生对心肌缺血再充氧和挽救心肌梗死至关重要。因此，本研究的重点是Au@Pt/Alg水凝胶对心肌梗死区血管化的影响。结果显示，携带BASCs的Au@Pt/Alg水凝胶组可分泌更多的VEGF。VEGF分泌增加可能是因为Au@Pt/ Alg水凝胶能有效保留和促进BASCs的活性和旁分泌能力，促进MI区VEGF因子的分泌和新生血管的形成。
Figure 5. 载BASCs的Au@Pt/Alg水凝胶对体内不同阶段心肌梗死的影响
MI区域Au@Pt/Alg水凝胶携带BASCs的机电一体化
研究表明，修复心肌梗死区的导电性对于心脏功能的恢复是非常重要的。导电性生物材料可以连接正常区域和心肌梗死区域，及时响应电信号，提高疤痕组织的导电性。预防心律失常，加强梗死心脏同步收缩，改善心功能，体外实验证明Au@Pt对CMs具有良好的导电促进性能。
首先，通过体表心电图记录评估不同治疗组的QRS持续时间，我们发现心肌梗死后QRS持续时间明显增加，而Alg组无明显变化。但无论Au@Pt/Alg水凝胶组还是BASCs携带组，QRS持续时间均明显缩短。此外，通过电标测获得不同组心肌梗死的电传导，并计算传导速度。采用Langendorff灌注系统，心外膜激活标测法检测各组大鼠心脏，电极放置在健康组织和梗死组织之间进行检测。红色部分表示先激活位点，蓝色部分表示后激活位点，传导方向由红到蓝。可以清楚地看到，正常心脏的传导方向清晰有序，PBS组和Alg组电传导延迟，而Au@Pt/Alg水凝胶组和携带BASCs的Au@Pt/Alg水凝胶组加速了激活传导。此外，无论是否携带BASCs，Au@Pt/Alg水凝胶均表现出较高的传导速度。
研究表明，心肌梗死中弱兴奋性瘢痕组织可阻断非梗死心肌电信号的传递，从而可能导致室性心律失常，而注射Au@Pt/ Alg水凝胶可以有效减少心律失常发生。
Figure 6. 载BASCs的Au@Pt/Alg水凝胶对导电重建的影响
携带BASCs的Au@Pt/Alg水凝胶的心功能修复
在Au@Pt/Alg水凝胶组，Masson染色显示梗死区和边界区纤维化最小。特别是携带BASCs的Au@Pt/Alg水凝胶组左室(LV)壁厚明显增加，同时梗死面积也显著减小，大部分纤维化组织恢复到正常心肌。最后通过超声心动图评估心功能：PBS组左室分数缩短(LVFS)和左室射血分数(LVEF)明显降低，显示典型心肌梗死特征。Alg水凝胶组LVEF的改善有限，约为10%，Au@Pt/Alg水凝胶组和携带BASCs的Au@Pt/Alg水凝胶组LVEF和LVFS明显升高，LVIDS和LVIDD明显降低，表明泵血功能和心室充盈得到改善。本研究中，Au@Pt/Alg水凝胶在干细胞的帮助下，能有效调节梗死微环境，促进心肌电传导，显著改善心功能。
Figure 7. 载有BASCs的Au@Pt/Alg水凝胶对心肌梗死28 d后心肌结构及心功能恢复的影响
鉴于心肌梗死早期ROS损伤的电生理微环境和病理微环境特点，本研究中制备了Au@Pt/Alg水凝胶。发现Au@ Pt NPs的加入不仅能赋予Alg水凝胶抗氧化和抗炎功能，还能引入导电性能。Au@Pt NPs在体外ROS微环境中可有效消除ROS抗氧化应激损伤，增强心肌细胞动作电位释放频率，进一步降低巨噬细胞炎症因子。它在有效清除ROS和炎症微环境，加速心肌梗死区的电传导方面起着关键作用。此外，通过改善植入BASCs的保留和存活以及血管生成，进一步促进MI的修复效果。相关研究结果证明了Au@ Pt/Alg水凝胶的优势及其作为干细胞载体在心脏修复中具有潜在价值。
