IP3R1-GRP75-VDAC1复合物介导糖尿病心房重构中的内质网应激-线粒体氧化应激

简介：

2022年3月21日，天津医科大学第二医院心脏科刘彤教授团队在Redox Biology杂志发表了题为“IP3R1/GRP75/VDAC1 complex mediates endoplasmic reticulum stress-mitochondrial oxidative stress in diabetic atrial remodeling”的文章，阐明了内质网应激-线粒体氧化应激在糖尿病患者心房重构和房颤诱发中的潜在作用。

背景：

糖尿病(DM) 易诱发心房重构，增加房颤（AF）发生的风险。此前已研究了氧化应激和炎症在糖尿病动物心房重构和AF中的作用，且证实抗氧化疗法对预防心房重构有效。但抗氧化剂在预防和治疗房颤方面的作用尚未在临床得到有效应用。因此识别潜在药物靶点、阐明其作用机制（如与能量代谢、细胞钙调控和电传导相关的途径）尤为重要。

内质网应激（ERS）是细胞为应对内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及Ca2+紊乱等状况而产生的一种保护性应激反应。细胞内的钙水平失调、氧化还原稳态失衡等因素都可诱发ERS。目前，ERS与线粒体功能障碍是引起2型糖尿病（II型糖尿病）心房重构、诱发房颤的重要因素，但这些过程中的分子机制以及它们之间的相互作用尚未完全阐明。

内质网与线粒体通讯的接触点称为线粒体相关内质网膜(MAM)，研究表明，电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）通过MAM相关的葡萄糖调节蛋白75 (GRP75，或热休克蛋白家族A成员9 [HSPA9])与三磷酸肌醇受体(IP3R1)连接，GRP75直接调控钙从内质网向线粒体的转移。在心衰和缺血/再灌注(I/R)损伤中，钙信号在兴奋-收缩耦联和钙超载造成的不利影响中发挥着重要的生理作用。

作者在此次研究中评估了衣霉素(TM)诱导的ERS对心功能、心肌细胞超微结构和线粒体功能的影响。在糖尿病模型中，以GRP75为起点，研究钙通过IP3R1-GRP75-VDAC1复合物从ER转移到线粒体是否可能在线粒体钙超载和随后心肌细胞死亡中发挥作用，从而为糖尿病性房颤的预防和治疗提供新的思路和靶点。

关键词：

内质网应激、线粒体、IP3R1-GRP75-VDAC1复合物、糖尿病、房颤

方法与技术：

电生理标测、Western blot、超声心动图、透射电镜、原位邻近连接（PLA）、免疫荧光染色、流式细胞术、Masson染色

结果：

1、II型糖尿病大鼠模型的ERS上调

图1. ERS在II型糖尿病大鼠模型中上调

为了检测II型糖尿病大鼠模型中ERS是否存在，作者检测了ERS标记物GRP75、CHOP、XBP1的水平，结果发现II型糖尿病组大鼠的LA组织中GRP78、CHOP水平显著升高，加入ERS抑制剂4-PBA处理后可预防这些变化（图1A-F）。同时，与对照组相比，II型糖尿病组AF的诱发率显著升高（75％），4-PBA处理后可将其降低至20％（图1H）。

2、ERS可增加IP3R1-GRP75-VDAC1复合物在心脏中的表达

图2. IP3R1-GRP75-VDAC1复合物在心脏内质网和线粒体之间起着重要作用

作者通过MS（质谱）实验证实GRP75为强相互作用蛋白（图2A），且免疫荧光显示IP3R1、GRP75、VDAC1在HL-1细胞中共定位（图2B）。原位邻近连接实验结果显示TM处理后，IP3R1-GRP75，GRP75-VDAC1和IP3R1-VDAC1间的相互作用显著增强，IP3R1-GRP75-VDAC1复合物蛋白表达增加（图2C、D）。

3、GRP75在钙从内质网转移到线粒体的过程中起到重要作用

图3. GRP75在内质网-线粒体钙交换中起重要作用

作者采用small interfering RNA沉默GRP75基因（以下简称GRP75 siRNA），发现加入siRNA后，可下调GRP75 mRNA和蛋白表达水平（图3A-C）。采用Fluo-4对细胞质的钙进行染色，发现与对照组相比，TM组细胞质的钙荧光强度显著增加，但在加入siRNA处理后，TM组的细胞质钙的荧光强度没有显著影响（图3D、E）。且TM处理后，线粒体的钙积累显著高于对照组（图3F、G），同时增加了VDAC1和MCU（线粒体钙离子通道蛋白）在线粒体膜上的表达，GRP75 siRNA处理使这一增加幅度显著降低（图3H-J）。随后作者通过透射电镜发现GRP75 siRNA组与NC siRNA组相比，ER与OMM的平均距离更大。与NC siRNA + TM组相比， GRP75 siRNA + TM组的内质网线粒体距离增加(图3K、M)，通过内质网进入线粒体的钙减少，从而减少了线粒体钙超载。以上数据表明，抑制IP3R1-GRP75-VDAC1复合物可以阻止内质网钙向线粒体的转移，并减轻线粒体钙超载。

4、抑制GRP75可减少ROS，改善心房肌细胞线粒体功能

图4. 抑制GRP75对心房肌细胞线粒体功能的影响

作者使用DCFH-DA和Mito Sox Red检测HL-1细胞内和线粒体ROS水平。结果发现TM诱导的ERS降低了氧化应激的关键酶Mn-SOD的活性(图4E、F)，且GRP75 siRNA处理可显著降低TM诱导增加的细胞及线粒体中的ROS水平(图4A-D)。这些结果表明，受ERS作用的HL-1细胞氧化应激增加，线粒体可能在这一过程中发挥重要作用。Δψm（线粒体膜电位）的破坏被广泛认为是细胞凋亡过程中最早的事件之一。作者使用JC-1检测Δψm，正常的线粒体会发出强烈的红色荧光。TM处理后，显现出绿色荧光，而GRP75 siRNA + TM组则发出红色荧光(图4G、H)。且GRP75下调可显著改善ERS诱导的线粒体功能障碍(图4I-L)。

5、抑制GRP75可保护HL-1细胞免受ERS诱导的凋亡

图5. 抑制GRP75对细胞凋亡的影响

结果发现，与对照组相比，TM显著增加HL-1细胞凋亡，而GRP75 siRNA显著降低TM诱导的细胞凋亡(图5A)。ERS降低抗凋亡蛋白的表达，上调凋亡蛋白的表达，从而触发HL-1细胞凋亡，而GRP75 siRNA可明显减弱细胞凋亡(图5B-E)。

6、抑制GRP75可减轻小鼠心房重构和房颤的进展

图6.　抑制GRP75对Hspa9敲除小鼠超声心动图的影响

作者利用心脏特异性Hspa9敲除小鼠(Myh6-Cre+/ Hspa9flox/flox )来证实GRP75的作用。发现Hspa9敲除后小鼠心脏GRP75蛋白的表达降低约80%(图6A、B)。超声心动图数据显示，LAD（左房腔直径）、LVEF（左室射血分数）、FS（缩短分数）在四组间无明显差异(图6C-F）。

图7. 抑制GRP75对Hspa9敲除小鼠心房重构和房颤的影响

采用多通道电生理标测系统标测兴奋传导等参数变化，发现Hspa9敲除后可显著恢复TM诱导的LA传导紊乱(p<0.001，图7A)，降低LA的绝对不均一性(P <0.001，图7C、D)，但仅部分改善LACV（左房传导速度）（p=0.11，图7B）。四组间SCL(窦房结周期长度)和AVWCL（房室文氏周期长度）无显著差异(图7E)。Hspa9敲除后可显著缩短因TM诱导延长的SNRT（窦房结恢复时间）(图7F)、缓解缩短的AERP（心房有效不应期）(图7G)，并显著降低AF的发生率（图7H、I)。利用HE和Masson三色染色检测LA形态变化(图7J)发现，与对照组相比，TM组心房肌细胞炎症浸润增加，广泛间质纤维化，GRP75敲除减轻了这些变化(图7K)。以上结果表明，敲除关键基因GRP75可以改善ERS诱导的心房重构，降低房颤进展。

结论：

图8.　IP3R1-GRP75-VDAC1复合物影响糖尿病心房重构的作用机制

1、IP3R1-GRP75-VDAC1复合物介导在糖尿病心房重构中的ERS-MAM-线粒体氧化应激，ERS抑制剂4-PBA可阻止这些变化；
2、沉默或敲除关键基因GRP75可抑制ER-线粒体的钙转运，减轻线粒体氧化应激，防止钙超载，从而预防糖尿病心房重构。

解读文献：

Yuan M, Gong M, He J, Xie B, Zhang Z, Meng L, Tse G, Zhao Y, Bao Q, Zhang Y, Yuan M, Liu X, Luo C, Wang F, Li G, Liu T. IP3R1/GRP75/VDAC1 complex mediates endoplasmic reticulum stress-mitochondrial oxidative stress in diabetic atrial remodeling. Redox Biol. 2022 Mar 21;52:102289. doi: 10.1016/j.redox.2022.102289. Epub ahead of print. PMID: 35344886; PMCID: PMC8961221.

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