近日，河北医科大学许彦芳教授团队在Heart Rhythm杂志发表了题为“Inhibitory G-protein-mediated modulation of slow delayed rectifier potassium channels contributes to increased susceptibility to arrhythmogenesis in aging heart”的研究论文。研究表明：β-肾上腺素能受体(βAR)激活引起老年豚鼠心脏IKs的急性降低，该过程是通过β2AR-Gi信号通路介导的；βAR导致的IKs抑制应该是增加年老心脏心律失常易感性的原因之一。
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前言：
心律失常是心血管疾病患者死亡的主要原因。心血管疾病死亡的患者中老年人占主要部分，年龄是心律失常发生的独立危险因素。目前，对离子通道如何导致老年人心律失常易感性增加的主要原因尚不完全清楚。
延迟整流K+通道是决定心室动作电位 (AP) 形态和时程的关键分子基础。这些通道的功能障碍可能发生尖端扭转型室性心动过速（TdP）甚至发生猝死。复极化延迟整流钾电流(IK)由缓慢激活成分(IKs)和快速激活成分(IKr)组成，参与动作电位复极的2期和3期。研究表明：IKr在静息生理条件下AP复极化中起主导作用，而当运动和应激导致交感神经兴奋增加时，β-肾上腺素能受体(βAR)刺激会使IKs迅速增强，导致AP复极加速，心室复极偏倚依赖IKs。
IKs的年龄依赖性功能变化的研究有限，有研究报道，年老果蝇心律失常发生率显著升高并伴随人类KCNQ1果蝇同源基因表达降低。这一发现提示IKs功能障碍可能与年老心脏心律失常易感性增加有关。然而，到目前为止，还没有证据表明哺乳动物心脏的IKs与年龄有关。因此，开展此项研究，以评估与年龄相关的豚鼠心脏的功能变化并探讨其潜在的机制，以了解与年龄相关的心脏易受心律失常影响的分子基础。
目的：
本次研究的目的是探索IKs对β-肾上腺素能受体(βAR)激活反应与年龄的相关性变化。
方法：
1.采用全细胞膜片钳记录法记录K+电流。
2.采用高分辨荧光标测方法记录离体心脏动作电位的变化。
结果：
1.心律失常易感性的年龄相关差异
在幼龄动物中，Iso通常以浓度依赖的方式缩短QTc。然而，在年老的豚鼠心脏中，QTc间期缩短的程度远小于幼龄心脏。此外，年老动物的室性早搏次数明显大于幼龄动物，严重室性心律失常(如室性心动过速[VT]/室颤[VF])发生率在老龄心脏为4/5，幼龄心脏为1/8。
图2. 心律失常易感性的年龄相关差异
2.豚鼠心室肌细胞中IKs的年龄依赖性功能改变
IKs和IKr电流密度、通道蛋白表达量在幼龄和年老动物心脏之间没有显著差异。
图3. IKs和IKr电流密度、通道蛋白表达量在幼龄和年老动物心脏之间没有显著差异
Iso可浓度依赖性的增加幼龄动物的IKs电流，激活曲线左移(V1/2：32.23±2.29 mV vs 26.15±2.15 mV)；但对年老动物的心室肌细胞中的IKs是浓度依赖性抑制，激活曲线无显著变化。此外，AC激活因子forskolin(10 uM)引起IKs尾电流密度的显著增加，表明在年老的心室肌细胞中IKs通道对cAMP-PKA维持正常反应。
图4. Iso干预对IKs影响的年龄相关性差异
3.IKs对βAR刺激抑制反应的信号通路
为检测参与IKs抑制作用的受体亚型，在β1AR拮抗剂CGP20712A(300 nM)存在的情况下，Iso(1和3 uM)仍然诱导年老的心室肌细胞中IKs降低，而在β2AR拮抗剂丁毒胺(10 uM)存在时，Iso引起IKs的增强。这一结果表明β2AR介导了年老豚鼠心室肌细胞Iso对IKs的抑制，而不是β1AR。
图5. 选择性β-肾上腺素受体拮抗剂和G蛋白抑制剂对异丙肾上腺素(Iso)诱导的IKs抑制的影响
据报道，除了激活Gs信号通路外，心脏β2AR还与抑制G蛋白(Gi)结合，Gi对百日咳毒素(PTX)敏感，推测Gi信号可能与ISO对年老豚鼠心脏IKs的抑制作用有关。在1.5 ug/mL的PTX预培养年老心肌细胞，以完全灭活心肌细胞中的Gi活性下，Iso对IKs有明显的增强作用。表明Gi通过β2AR调控年老心室肌细胞的IKs。
图6. 抑制G蛋白(Gi)过表达对HEK293细胞中IKs的影响
豚鼠心脏IKs较多，与包括人在内的其他哺乳动物有所不同，在稳定共表达人KCNQ1/KCNE1的HEK293细胞中观察了Iso诱导的应答，进一步证实了β2AR-Gi信号调控对IKs的影响。当瞬时转染β2AR后，ISO(1 uM)诱导IKs电流增强；但当β2AR和Gi2 cDNA共转染细胞时，Iso对IKs有明显的抑制作用，而PTX可逆转Iso对IKs的降低。此外，Gβγ抑制剂gallein(100 uM)、PLC抑制剂U73122(1 uM)和蛋白激酶C(PKC)抑制剂Bis-1(100 nM)预处理均可阻止Iso诱导的IKs降低，提示Gβγ、PLC和PKC可能作为Gi的下游效应物。
图7. 抑制G蛋白参与IKs抑制的潜在下游效应的测定
4.β2AR-Gi在离体灌注心脏室性心律失常中的作用
为了证实Gi介导的信号在年龄依赖性心律失常发生中的作用，作者开发了由cTNT启动子驱动的rAAV9- Gi2构建物，以在心脏中特异性表达重组Gi。将构建物通过静脉注射(4×1011病毒颗粒)注入年轻的豚鼠，rAAV9-EGFP作为对照，不同组织的荧光成像表明病毒载体完全转染在心脏。在年轻心脏中过度表达Gi2(2倍)发现，在Gi过表达的年轻心脏中，Iso缩短QTc间隔的程度远小于对照组。且与对照组相比，过表达组Iso诱发室性早搏和室速/室颤发生率更高，其反应与年老动物对心律失常易感性的反应相似。观察IKs对Iso的反应发现，对照组中8/9 IKs增加，Gi过表达组13/16 IKs被抑制。对年老和Gi过表达的年轻心脏进行PTX预处理后，Iso不会诱发室性心律失常；同时，QTc呈浓度依赖性缩短。
图8. 抑制G蛋白过表达对年轻豚鼠的影响
5.Optical Mapping评估离体心脏心律失常的发生趋势
PES诱发性试验显示，年老心脏(4/5)的多态VT/VF倾向明显高于年轻心脏(0/4)，传导时间图提示PES后老年心脏心室发生折返。进一步证明，年老豚鼠的心脏较年轻豚鼠更易发生室性心律失常。在Iso灌注过程中，年老豚鼠心脏AP出现明显的电交替，进而发展为快速型心律失常，年老心脏的传导出现传导阻滞及折返。而PTX预处理可防止Iso诱导的年老心脏异常电活动。研究结果进一步揭示了年老心脏对快速心律失常的高度易感性。
图9. 离体灌注心脏的折返和室性心律失常倾向的动作电位及传导图
结论：
β-肾上腺素能受体(βAR)激活引起老年豚鼠心脏IKs的急性降低，该过程是通过β2AR-Gi信号通路介导的；βAR导致的IKs抑制应该是增加年老心脏心律失常易感性的原因之一。交感神经兴奋性增加是老年人各种应激条件下室性心律失常或合并心血管疾病的重要原因。
总结：
1.βAR激活可导致IKs的年龄依赖性抑制；
2.β2AR-Gi信号通路通过βAR刺激介导IKs抑制；
3.Gi信号与年老心脏心律失常易感性增加有关。
参考文献：
[1]Zou S, Qiu S, Su S, Zhang J, Sun J, Wang Y, Shi C, Xu Y. Inhibitory G-protein-mediated modulation of slow delayed rectifier potassium channels contributes to increased susceptibility to arrhythmogenesis in aging heart. Heart Rhythm. 2021 Sep 15:S1547-5271(21)02124-X. doi: 10.1016/j.hrthm.2021.09.014. Epub ahead of print. PMID: 34536591.