背景：
心房颤动(atrial fibrillation，AF)是最常见的心房持续性心律失常，其发病率和死亡率极高。近年来，已有大量研究将AF的发生与心房线粒体功能障碍和心房重构联系起来。已证明心房线粒体活性氧（ROS）损伤、心房的电重构和结构重构是AF发生的重要基础。
支链氨基酸（BCAAs，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）是一组必需氨基酸，在哺乳动物中，BCAAs的体内分解代谢途径主要是由线粒体酶支链氨基转移酶(BCATs)和支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)复合物控制。其中，BCKDH是BCAA分解代谢的限速酶。BCKDH的活性是通过可逆磷酸化来调节的。BCKDH被线粒体靶向的2C- typeSer/Thr蛋白磷酸酶(PPM1K)去磷酸化后被激活，而被支链α-酮酸脱氢酶激酶(BCKDK)磷酸化后失活。哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)是亮氨酸的下游靶点，与心肌纤维化和心肌肥厚密切相关。mTOR被激活后会进一步磷酸化，并激活p70S6激酶(p70S6K)，p70S6K反过来介导核糖体蛋白S6 (RPS6)的磷酸化，RPS6是40S核糖体蛋白的组成部分。BCAA分解代谢缺陷可增强mTOR-p70S6K-RPS6信号通路的转导，加重心肌梗死后的心功能障碍和结构重塑。
KLF15是BCAA代谢酶的关键转录因子，是cAMP反应元件结合蛋白(CREB)信号转译的下游靶点。CREB Ser133位点的磷酸化可以通过增加BCAT2和BCKDHA的表达，积极调控CREB与KLF15启动子区域的结合，增强BCAA的分解代谢。近年来的研究表明，BCAA分解代谢缺陷和BCAA或BCAA代谢物的升高在心肌梗死、心脏代谢疾病和心力衰竭中起着关键作用。然而，心房BCAA分解代谢的改变在房颤中的作用仍在很大程度上是未知的。
褪黑素（MLT）具有多种抗氧化活性，能有效降低心肌缺血再灌注时室性心律失常的发生。先前的研究表明褪黑素可通过恢复动作电位时程和静息膜电位来发挥这些作用。最近的一项临床研究表明，口服褪黑素可显著缩短冠状动脉搭桥术(CABG)术后房颤的持续时间，但其潜在机制尚不清楚。本文作者已证实了蛋白激酶G (PKG)介导褪黑素对缺血/再灌注损伤的心脏保护作用。同时有关PKG诱导的CREB信号转导在中枢神经系统中的有益作用已广泛研究。
因此，本研究旨在探索BCAA分解代谢在房颤发生中的潜在作用，并以PKG-CREB-KLF15通路为重点，进一步评价褪黑激素的治疗作用。
关键词：
褪黑素、支链氨基酸（BCAA）、房颤、KLF15、PKG、线粒体、活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）、氧化谷胱甘肽（GSSG）
研究方法：
超声心动图、Massoon染色、免疫荧光染色、透射电镜术、Western blot
Electrophysiological mapping（电生理标测）：在电生理实验中，动物被麻醉（1%戊巴比妥钠）并进行呼吸机插管。然后，通过左胸廓切口暴露左心房（LA）。在LA表面通过放置多电极阵列(8×8，间距0.35mm)获得心外膜传导信号。这些数据经多通道电生理标测系统（MappingLab Inc，UK）的放大器与数模转换器转换传输到计算机上。使用EMap Scope v3.0软件(MappingLab Inc.，UK)获取平均传导速度、绝对不均匀性和不均匀性指数。
研究结果：
1、Ang Ⅱ、BT2和褪黑素对心房BCAA分解代谢的影响
有研究表明，采用血管紧张素II（Ang Ⅱ）处理的动物模型，可表现出与肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）激活、心房结构重构和电重构相关的房颤等级，故本研究采用Ang Ⅱ处理小鼠，探讨房颤发病过程中心房BCAA的分解代谢水平变化。BT2（3,6-二氯苯并[b]噻吩-2-羧酸）为BCKDK的变构抑制剂，阻止其与BCAA分解代谢的限速酶BCKDH的结合，从而阻止BDKDH的失活。
图1 Ang Ⅱ处理小鼠的心房BCAA分解代谢及褪黑素的作用
可以看出，Ang Ⅱ会导致心房BCAA的分解代谢缺陷，加入BT2、MLT后，可显著降低由Ang Ⅱ引起的心房中BCAA浓度的升高，同时，显著降低BCKDHA的磷酸化以及BCKDK的表达，增强了代谢酶BCKDHA的活性，但对BCAT2以及PPM1K的表达均无显著影响。
2、BT2和褪黑素对Ang Ⅱ诱导的心房电重构的影响
图2 BT2和褪黑素对Ang Ⅱ诱导的心房电重构的影响
与Ang Ⅱ处理组相比，加入BT2和MLT能够显著降低AF的诱发率及持续时间，缓解因Ang Ⅱ处理而降低的心外膜传导速度，同时降低左心房的绝对不均一性和不均一性指数，减弱Ang Ⅱ诱导的LA腔室扩大。
3、BT2和褪黑素对Ang Ⅱ诱导的心房结构重构和线粒体氧化损伤的影响
图3 BT2和褪黑素对Ang Ⅱ诱导的心房结构重构和线粒体氧化损伤的影响
BCAA分解代谢紊乱会导致心房结构重构，BT2和MLT可显著降低Ang Ⅱ诱导的心房纤维化，同时对Ang Ⅱ诱导的线粒体氧化损伤具有明显的保护作用。
4、BCAA、褪黑素和KT5823对Ang Ⅱ诱导的心房电重构、结构重构以及线粒体氧化损伤的影响
发现与Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ+BCAA组会进一步增加心房的电重构和结构重构同时加重心房线粒体的氧化应激损伤。而MLT治疗能够显著逆转BCAA的这一有害作用，但KT5823（KT5823为PKG的选择性抑制剂）的联合给药阻断了MLT对心房的保护作用。同时，Ang Ⅱ虽会造成CREB和KLF15的表达代偿性的增加，但PKG并没有激活，也就是说这种表达的增加是无效性的。从图5N、P、Q可知，补充BCAA会抑制PKG-CREB-KLF15通路的信号转导，而MLT联合给药可逆转这一作用，表明PKG诱导的CREB-KLF15可能参与MLT的保护作用。
图4 BCAA、褪黑素和KT5823对Ang Ⅱ诱导的心房电重构的影响
图5 BCAA、褪黑素对Ang Ⅱ诱导的小鼠心房结构重构、线粒体氧化损伤和PKG-CREB-KLF15信号转导的影响
5、抑制PKG对褪黑素抗心房重构和线粒体氧化损伤的影响
图6 抑制PKG对褪黑素抗心房结构重构和线粒体氧化损伤的影响
结果如图6所示，在加入PKG的抑制剂KT5823后，线粒体的氧化损伤和形态异常均会加重，PKG-CREB-KLF-15的表达活性显著降低（图6L和M），同时抑制了BCAA的分解代谢（图6I－K），但对PPM1K的表达无明显影响，由此表明，PKG的抑制显著降低了MLT的治疗作用，且心房的PKG-CREB-KLF-15信号通路在MLT的治疗作用中发挥了关键作用（图7）.
图7 BCAA分解代谢缺陷在房颤发生过程中的作用，以及褪黑素在这种情况下的治疗作用的潜在机制模型
结论：
1、BCAA的分解代谢缺陷会加重组织纤维化和线粒体ROS损伤，从而诱导房颤的发生；
2、褪黑素通过增强BCAA的分解代谢抑制房颤的发展；
3、褪黑素通过激活PKG－CREB－KLF15通路降低心房重构；
4、本研究揭示了促进AF发生的其他机制，并强调了通过靶向BCAA分解代谢治疗AF的新方法。
解读文献：
Yu LM, Dong X, Zhao JK, Xu YL, Xu DY, Xue XD, Zhou ZJ, Huang YT, Zhao QS, Luo LY, Wang ZS, Wang HS. Activation of PKG-CREB-KLF15 by melatonin attenuates Angiotensin II-induced vulnerability to atrial fibrillation via enhancing branched-chain amino acids catabolism. Free Radic Biol Med. 2022 Jan;178:202-214. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2021.11.043. Epub 2021 Dec 2. PMID: 34864165.