背景：
心肌梗死(MI)是由于冠状动脉突然阻塞而引起的心肌缺血、坏死、心力衰竭，是世界范围内心肌病发病率和死亡的主要原因。由于心肌细胞(CMs)再生能力较弱，恶化过程通常是不可逆的。此外，传统药物和干预无法重建弹性传导微环境来逆转心肌梗死和心功能恶化。由支架和治疗细胞组成的工程心脏补片(ECPs)具有构建再生微环境和修复心肌梗死的潜力。
碳基纳米材料(石墨烯和聚吡咯(pPy))已被应用于ECPs的制备。氧化石墨烯(hGO)纳米片是一种基于氧化石墨烯的新型石墨烯衍生物，已广泛应用于心脏组织工程。pPy纳米粒子可防止hGO纳米片在低温凝胶中重新堆叠，并提高其仿生弹性和韧性。既往研究表明，预血管化ECPs可通过结构性血管吻合与梗死心肌连接，实现功能整合。这种相互作用有助于加速再灌注以及各种因子(VEGF、FGF、IGF)对梗死区域的递送。
方法：
Langendorff灌流、Electrical Mapping、超声心动描记术、免疫荧光染色、Masson染色、3D共聚焦成像、共定位灰度分析、RNA测序
关键词：
工程心脏补片(ECPs)、心梗 (MI)修复、导电弹性贴片、Electrical Mapping
方案1：血管化传导弹性ECP的制备及其对梗死心脏的修复作用流程及示意图
结果：
1.导电低温凝胶的制备与表征
首先，作者制备了hGO和hGO/pPy的混合物。为了获得理想的类心脏力学性能和导电性，将hGO/pPy悬浮液以六种不同的比例引入到p(HEMA)预制凝胶中(0, 1:0, 1:0.5, 1:1, 1:3, and 1:5 w/w) ，分别还原形成低温凝胶H、 HrhG、HrhGP0.5、HrhGP1、HrhGP3和HrhGP5。
通过扫描电镜(SEM)发现，所有的低温凝胶都表现出相互连接的多孔结构，且随着hGO/pPy比的增加，低温凝胶的平均孔径逐渐减小。之后通过应力-应变试验发现，将hGO纳米片掺入p(HEMA)低温凝胶中可增加凝胶的刚度，较高的杨氏模量证明了这一点。此外，还发现，与HrhG相比，以0.5:1的比例掺入pPy可以有效阻止hGO纳米片的堆积，并降低杨氏模量。其中HrhGP0.5和HrhGP1的杨氏模量属于天然心肌范围。循环压缩试验后，HrhGP0.5和HrhGP1完全完好，而HrhGP3和HrhGP5破裂。(图1)
图1：不同低温器的表征
2.低温凝胶的电化学性能
接下来，作者使用循环伏安法(CV)测试了6种低温凝胶的导电性。研究发现，在hGO纳米片中加入pPy纳米颗粒可提高HrhG的电导率和低温弹性。此外，CV测试还表明，hGO可以作为hGO/pPy中pPy纳米粒子的电稳定剂。并且，HrhGP0.5具有与天然心肌相似的稳定的电特性。(图2)
图2：不同低温器的电化学性能
3.预血管化导电弹性低温凝胶的构建
活/死细胞染色实验发现，在H、HrhGP0.5和HrhGP1中，CMs具有良好的生物相容性。由于HrhGP0.5具有与天然心肌相似的力学和电学特性，所以，作者使用该低温凝胶构建了v-HrhGP0.5。荧光溶液灌注通道结果表明，ch-HrhGP0.5中成功形成了管道通道。
然后，将DiI和DiO标记的RAEC分别培养在ch-HrhGP0.5通道内外，观察v-HrhGP0.5中ev与通道外RAEC形成的自组装血管(SAs)之间的血管萌生及吻合情况。在动态培养条件下，3D共聚焦成像和共定位灰度分析发现，导电弹性支架(HrhGP0.5)比非导电支架(H)更能促进SA的形成，且HrhGP0.5中ev延伸出的清晰的芽状结构出现血管吻合。之后抗血栓活性评价实验进一步表明，HrhGP0.5中的ev具有与天然血管相似的功能，并可以在一定刺激下诱导形成血栓。(图3)
图3：基于hrhgp0.5的全血管支架的构建。
4.v-HrhGP0.5工程心脏贴片促进心肌细胞功能化和同步收缩
作者将v-HrhGP0.5支架与CMs共培养，构建全血管化的导电弹性ECP (v-HrhGP0.5 ECP)。为了检测其对心肌功能的影响，作者检测了心脏特异性蛋白α-肌动蛋白和CX-43的表达水平。研究发现，v-HrhGP0.5 ECP中α- actitin和CX-43蛋白的表达量显著高于非血管化HrhGP0.5 ECP，且在v-HrhGP0.5 ECP的EV附近观察到许多成熟的肌节。此外研究还表明，v-HrhGP0.5 ECP促进了CMs的功能化和同步收缩。(图4)
图4：v-HrhGP0.5 ECP提高了心肌特异性蛋白表达水平、Ca2+瞬时传播和CMs的同步收缩。
5.v-HrhGP0.5工程心脏贴片通过功能血管吻合和电整合修复梗死心肌
作者构建了一个MI大鼠模型和大鼠的不同治疗组（单纯细胞注入(CMs和CMs + RAECs)，纯支架移植(H和HrhGP0.5)和ECP移植(H ECP, HrhGP0.5 ECP和v-HrhGP0.5 ECP)）以评价移植体内的影响。免疫染色研究结果显示，v-HrhGP0.5 ECP移植后梗死区出现血管样结构，且能成功地与梗死心脏建立功能性血管吻合，促进其血运重建。(图5)
图5：各组心肌梗死区血管化水平及心肌与梗死心肌间功能性血管吻合情况
图6：使用64通道电极阵列测绘系统对研究组移植后4周的心脏电传导进行评估。
电信号及心功能检测表明，v-HrhGP0.5 ECPs能促进兴奋从健康心肌向梗死心肌的传播，并使梗死区出现几乎同步的电传播，显著提高梗死心脏的传导速度，改善梗死左心室的收缩功能和搏动顺应性，逆转左室恶性扩张。此外Masson和免疫荧光染色结果显示，相比其他组，v-HrhGP0.5 ECP可产生最小的梗死面积和最厚的心室壁，并增加梗死区域CX-43和α- actitin的表达水平。(图6、7、8)
图7：应用超声心动图对移植前和移植后4周不同组的心功能进行评估。
图8：不同组ECP移植术后4周心脏切片组织学评价。
6.传导微环境和动态培养条件下心肌细胞全转录组RNA测序分析
最后，作者利用全转录组RNA-seq在体外探索了导电微环境和动态培养条件影响CMs功能化的潜在机制。研究发现，导电性微环境上调肌动蛋白细胞骨架和紧密连接通路的表达，导致CM成熟增加，而动态培养上调心肌收缩和ATP生物合成通路的表达，导致心肌收缩升高，ATP生物合成增加。(图9)
图9：在静态培养和动态培养条件下，分别对H ECP和HrhGP0.5 ECP培养的细胞质中差异基因进行转录谱分析和RNA测序，并对ch-HrhGP 0.5 ECP培养的细胞质中差异基因进行测序
结论：
作者开发了一种新型的多功能ECP，具有综合的导电性、弹性和全血管化，继而证实了这种ECP可以促进CMs的功能化和同步收缩，并通过梗死心脏大量的血管吻合和电整合发挥有效的MI修复作用。
参考文献：
1. Xiong, W., et al., A Vascularized Conductive Elastic Patch for the Repair of Infarcted Myocardium through Functional Vascular Anastomoses and Electrical Integration. Advanced Functional Materials. n/a(n/a): p. 2111273.
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