优化Nav1.7靶向镇痛药：揭示蜘蛛毒液衍生肽毒素的脱靶效应和改进策略

电压门控钠（Na_v）通道 Na_v1.7 在疼痛信号的感知中发挥着重要作用，抑制 Na_v1.7 通道是一种有潜力的止痛治疗策略。蜘蛛毒液中多种 Na_v1.7 抑制肽具有门控修饰毒素（GMTs）的功能，在新型镇痛药开发中备受关注，且可被设计为高亲和力和亚型选择性的模板分子。但研究发现肽毒素选择性不高，会对其他离子通道或未知靶标产生脱靶作用，引发严重副作用。所以，对于 Na_v1.7 靶向镇痛药，选择性至关重要，它能减轻副作用，减少非 Na_v1.7 靶点对 Na_v1.7 肽毒素的损失，提高靶向 Na_v1.7 的肽毒素有效浓度。

基于此，湖南师范大学刘中华教授、周熙副教授，湖南理工学院张云霄副教授共同通讯在Advanced Science发表：Optimizing Na_v1.7-Targeted Analgesics: Revealing Off-Target Effects of Spider Venom-Derived Peptide Toxins and Engineering Strategies for Improvement相关文章。

探索蜘蛛毒液中 hNa_v1.7 肽抑制剂在离子通道的交叉活性及揭示其潜在机制，从三个不同的蜘蛛毒素 NaSpTx 家族中选了 8 个肽，结果表明这些肽能抑制 rK_v4.2 和 rK_v4.3 通道，而抑制该通道可能导致严重心脏副作用，这给其在镇痛药物开发应用带来挑战。基于对肽毒素与 hNa_v1.7 和 rK_v4.2/4.3 分子相互作用的了解，设计出 mGpTx1 类似物 mGpTx1-SA，提高对 hNa_v1.7 的选择性，降低对 rK_v4.2/4.3 的抑制，使心脏毒性最小化，且在慢性炎症和神经性疼痛模型中有镇痛作用。随着 Na_v1.7 作为疼痛治疗靶点被积极研究，本研究发现可能为未来药物发现和开发副作用更小的镇痛药物提供见解。

1. 蜘蛛毒液衍生的 Na_v1.7 抑制剂对 rK_v4.2 和rK_v4.3 具有高抑制效果

研究分析蜘蛛毒液衍生肽毒素，新的 HNTX-VIIa 对 hNa_v1.7 抑制活性高。这些毒素有保守半胱氨酸模式和高度同源的 3D 结构，虽体外药理表现好，但体内有差异且高剂量有毒性。对 Na_v 通道亚型有选择性，也对心脏 K_v 通道有活性。八种毒素对 rK_v4.2/4.3 抑制呈电压依赖性。除 ProTx-II （Na_v1.7 钠通道的选择性阻滞剂）外，其他毒性不影响 Na_v1.7 激活和失活曲线，在亚饱和浓度下可调节 rK_v4.2/4.3 电压传感器。

图1. 来自 NaspTx 家族 1-3 的八种蜘蛛毒素的特性

2. rK_v4.2 S3-S4 连接子参与蜘蛛毒液衍生的hNa_v1.7 抑制剂

先前研究表明，特定连接子对毒素与 Na_v1.7 的结合具有重要作用。本研究比对人类、小鼠和大鼠的 Na_v1.7 DII 和 K_v4.2/4.3 的 S3 - S4 连接子等，发现相似性高且带负电荷。通过定点诱变分析，构建突变测定毒素抑制效能变化，表明负残基和侧链长度重要，研究其他毒素也显示多个氨基酸残基参与结合有差异，解释了对 rK_v4.2 和 rK_v4.3 的抑制具有相似性，虽连接体参与结合但不排除其他位点。

图2. rK_v4.2 的 S3-S4 连接子参与了八种毒素与 rK_v4.2 的结合

3. HNTX-III 具有靶向 hNa_v1.7 和 rK_v4.2 的重叠药效团

分子表面分析显示八种毒素有两亲性生物活性表面特征，以 HNTX - III 为例，评估其与 rK_v4.2 的构效关系，结果表明特定残基突变影响对 rK_v4.2 和hNa_v1.7 的抑制作用，强效类似物对 rK_v4.2/4.3 亲和力增加，表明药效团几乎重叠。

图3. HNTX-III 与 rKv4.2 相互作用涉及的关键残基

4. mGpTx1的类似物（mGpTx1-SA）与rK_v4.2/4.3 相比，hNa_v1.7 选择性显著提高

在探索 rK_v4.2 脱靶机制时，试图设计 HNTX - III 类似物以获得低 rK_v4.2/4.3 活性和高 hNa_v1.7 活性的优化肽。发现某些突变后选择性变化，引入 K25A 到 HNTX - III 类似物中导致抑制作用和再折叠效率有变化，说明其可能不是合适模板。mGpTx1有两个多肽 mGpTx1 - R25A 和 mGpTx1 - SA，其中 mGpTx1 - SA 对 hNa_v1.7 有强效和选择性活性，对其他通道影响小，提高了对 hNa_v1.7 的选择性比，且对其他 K_v 通道亚型及 Ca_v 通道抑制作用低。

图4. mGpTx1-SA 的选择性分析

5. mGpTx1-SA 通过降低对 rK_v4.2/4.3 的抑制作用来消除心脏毒性

抑制 rK_v4.2/4.3 可能导致心脏毒性。实验表明，5μM 的 mGpTx1 延长大鼠心肌细胞动作电位时程（APD），改变小鼠心电图及 RR 间期和心率等；而 mGpTx1-SA 在相同条件下无影响。总体数据显示，mGpTx1-SA 不具有延长心肌细胞APD的活性，说明其在降低心脏毒性方面有优势。

图5. mGpTx1-SA 的心脏毒性分析

6. mGpTx1-SA 降低背根神经节（DRG）神经元的膜兴奋性，防止炎症和神经性疼痛模型中的机械异常性疼痛

通过电压钳记录评估 mGpTx1 - SA 对 DRG 天然 Na ⁺ 和 K ⁺ 介导电流的影响，结果表明 mGpTx1 - SA 对河豚毒素敏感 Na_v 电流有抑制作用，可能降低 DRG 小神经元的膜兴奋性。在疼痛小鼠模型中，mGpTx1 - SA 比 mGpTx1 更有效，抗异动作用持续时间长，在慢性炎症和神经性疼痛模型中表现出良好的镇痛作用。

图6. mGpTx1-SA 对小鼠 DRG 神经元兴奋性的抑制作用及镇痛效果

7. mGpTx1-SA 的体内安全性得到改善

考虑到 mGpTx1-SA 对某些特定通道抑制减弱且这些通道有重要生理功能，测试其对小鼠运动能力的影响。结果显示，高剂量（2mg/kg，为镇痛有效剂量 60μg/kg 的 30 倍）的 mGpTx1-SA 不影响小鼠转棒平衡时间、游泳时间和小肠推进，也不影响小鼠在旷场试验中的探索和运动行为，表明其体内安全性较好。

结果表明，针对 hNa_v1.7 的特定蜘蛛肽毒素对 rK_v4.2/4.3 的脱靶抑制可能源于其高度的序列保守性。这一发现有助于设计 hNa_v1.7 特异性镇痛药物，以减少对 rK_v4.2/4.3 的抑制、减轻相关毒性，进而提高其在治疗应用中的适用性。