体外成熟策略提升人多能干细胞心肌细胞（hPSC-CMs）移植疗效与安全性：基于PDMS衬底的规模化制备与功能验证

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研究背景

心肌梗死（MI）是导致心力衰竭和死亡的主要原因。人类成体心肌细胞（CMs）再生能力极低，MI后大量心肌细胞不可逆丢失，形成瘢痕组织，最终可能发展为心力衰竭。尽管现有药物和介入治疗可延缓疾病进展，但无法真正修复丢失的心肌组织。

人类多能干细胞（hPSCs）具有分化为心肌细胞（hPSC-CMs）的潜力，为心脏再生医学提供了前所未有的细胞来源。早期研究表明，移植hPSC-CMs可在动物模型中部分重建梗死区心肌，并改善左心室功能。然而，这些移植细胞多呈现未成熟（fetal-like）表型，表现为细胞小、肌节无序、自律性高、传导速度慢、钙处理能力差、依赖糖酵解代谢等。这种不成熟状态限制了其在宿主体内的电整合能力，并增加了移植后室性心动过速（VT）的风险。因此，研究核心假设：如果在移植前通过体外培养手段促进hPSC-CMs的成熟，可能会改善其在体内的结构整合、电生理功能及安全性。

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研究目的

本研究旨在建立基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）衬底的可规模化、经济高效的hPSC-CMs体外成熟培养体系，系统比较不同成熟阶段（PDMS vs. 细胞培养塑材（TCP），20天 vs. 40天）hPSC-CMs的结构与功能特性，并在豚鼠心肌梗死模型中评估移植不同成熟度细胞后的组织学、电生理、心功能及安全性结局。

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研究方法

1. 细胞来源与基因编辑

使用人类胚胎干细胞系（ESI-17），通过CRISPR/Cas9敲入ASAP1基因，稳定表达绿色荧光电压感应蛋白，用于实时监测心肌细胞电活动。

2. 分化与成熟方案

采用定向分化法诱导hPSC向心肌分化。分化第6天，将细胞重新铺板于软质PDMS或硬质TCP衬底，分别培养至第20天或第40天，收获细胞用于体外表型分析或冷冻保存。

3. 体外表型分析

通过免疫荧光（细胞大小、肌节、Cx43、肌钙蛋白）、透射电镜（超微结构）、FuraRed2钙成像、ASAP1电压成像，以及qPCR和单细胞RNA测序，全面比较PDMS与TCP培养下心肌细胞的结构、功能及分子成熟度。

4. 动物模型与移植实验

采用豚鼠心脏冷冻损伤心肌梗死模型，分为对照组（vehicle）、TCP-20天、TCP-40天、PDMS-20天、PDMS-40天组，每个心脏注射1×10⁸个细胞，并于移植后14天、28天、56天评估。

5. 体内评估指标

组织学：瘢痕面积、移植物面积、肌节长度、Cx43定位、Ki67增殖指数；电生理：光学标测（ASAP1+RH237）、宿主-移植物耦联比例、传导速度、动作电位时程；心功能：超声心动图（左室短轴缩短率、内径）；心律失常：遥测ECG记录室性心动过速（VT）事件。

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主要结果

（一）PDMS培养可规模化生成结构功能更成熟的hPSC-CMs

PDMS细胞与TCP细胞纯度相近，但PDMS培养的MLC2v阳性比例和总产量更高，滚瓶体系节约成本。结构上，PDMS细胞更大、更细长、肌节更有序、Cx43表达及间隙连接斑块增大、多核化增加、成熟cTnI升高、未成熟ssTnI降低，电镜下Z线和M带更清晰、肌节更长、线粒体更大。功能上，PDMS细胞自发搏动更慢且规律，PDMS-40天细胞的传导速度接近成人心室水平，钙瞬变幅度更大、动力学更快。转录组显示PDMS细胞上调MYH7/MYH6、MYL2/MYL7、CASQ2等成熟标志，但单细胞测序与胎儿心脏数据比较提示未完全成熟。

图1. 在PDMS基质上培养可促进人多能干细胞来源的心肌细胞成熟

（二）移植PDMS培养的细胞可形成结构更优的移植物（14天）

各组瘢痕面积和移植物总面积无显著差异。但PDMS移植物细胞排列高度有序，肌节更长，Cx43表达更高且更集中于闰盘样结构。PDMS移植物中未成熟ssTnI和MLC2a表达下降，成熟cTnI和MLC2v表达升高，N-钙黏蛋白升高，增殖指数Ki67降低。

图2. PDMS成熟的hPSC-CMs形成的移植物具有更完善的肌节结构与排列以及更高的Cx43表达水平

图3. PDMS成熟的hPSC-CMs形成的移植物中，成熟心室标志物表达增强，而增殖指数降低

（三）移植PDMS培养的细胞具有更优的电整合特性（14天）

双通道光学标测显示，TCP移植物与宿主耦联差，而PDMS-40天移植物中几乎所有区域均与宿主1:1同步激活。定量结果：PDMS-40天1:1耦联率接近100%，TCP组<30%。PDMS移植物传导速度更快，动作电位幅值更大、上升时间更短；动作电位时程除TCP-20天组偏长外，其余无差异。

图4. PDMS成熟的hPSC-CMs可形成移植物，其宿主-移植物电机械整合及移植物电生理功能均得到改善

（四）移植PDMS培养的细胞可改善心功能并消除VT（28–56天）

PDMS-40天组在术后14至56天左室短轴缩短率（FS）显著高于TCP和对照组，左室扩张更轻。从移植前2天至移植后56天，对照组FS下降4.97%，TCP组改善1.86%，PDMS组改善8.25%。遥测ECG显示，PDMS组无一例VT（0%），对照组和TCP组均有16%出现VT。28天时PDMS移植物面积显著大于TCP组，56天仍有增大趋势；且结构更成熟。