【Circulation】：揭秘LMNA突变致心脏病的全新机制，为罕见肌营养不良症提供治疗新靶点

Emery-Dreifuss肌营养不良症（EDMD）是一种罕见的遗传病，典型表现为关节挛缩、进行性肌无力和严重心脏并发症。LMNA基因突变是EDMD最常见的遗传病因之一，与EMD突变患者相比，LMNA-EDMD患者更易出现扩张型心肌病和致死性室性心律失常，约20%最终需要心脏移植。尽管已有研究提示MAPK信号通路、自噬及DNA损伤应答可能参与其中，但LMNA突变导致心脏病理表型的分子机制仍不明确。

核膜蛋白lamin A/C在维持核结构、机械传导及染色质组织中的关键作用提示，其突变可能通过染色质失调引发下游基因表达异常。为阐明这一问题，浙江大学转化医学研究院/浙江大学医学院附属第一医院梁平教授团队联合浙江大学医学院附属第一医院柯青教授团队以及浙江大学动物科学学院庄乐南教授团队在Circulation杂志发表题为“WNT5a-Mediated Aberrant Actin Filament Dynamics

Drive Cardiac Pathogenic Phenotypes in LMNA-Related Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy”的研究论文。

本研究利用患者特异性诱导多能干细胞分化的心肌细胞、工程化心肌组织及敲入小鼠模型，结合基因编辑技术，系统探讨了LMNA-EDMD心脏致病表型的潜在机制。

1. 临床样本与遗传分析

采集EDMD患者家系的外周血、皮肤、肌肉及血清，通过全外显子组测序和Sanger测序，验证了LMNA基因的不同突变位点及其在家系中的共分离情况。

2. 细胞模型构建

利用非整合型仙台病毒将患者及健康对照的成纤维细胞重编程为iPSC，再经小分子单层分化获得高纯度心肌细胞（iPSC-CM）；同时采用CRISPR-Cas9修复LMNA L204P突变，构建了患者来源的疾病模型和等基因对照模型。

3. 多组学机制探索

对对照组和EDMD组的iPSC-CM进行RNA-seq（转录组）、ATAC-seq（染色质开放性）和CUT&Tag（LMNA蛋白在染色质上的结合），发现了WNT5A是LMNA突变后下调最显著且直接结合受损的关键基因。

4. 细胞结构与功能验证
 

•结构：通过免疫荧光、超分辨显微镜和透射电镜，验证了EDMD心肌细胞存在肌节紊乱和核膜皱缩/泡状变形。
 

•电生理：利用膜片钳和多电极阵列（MEA），验证了动作电位异常、心律失常发生率升高及传导不规则。
 

•收缩功能：使用细胞收缩与钙成像标测技术，验证了单细胞收缩幅度降低和不规则收缩比例增加。
 

•肌动蛋白动力学：通过CytoD洗脱实验、鬼笔环肽染色及RhoA活性检测，验证了F-actin聚合能力下降、肌动蛋白动力学异常。
 

•Cx43转运：采用FRAP实验和共聚焦成像，验证了Cx43在细胞膜边界的分布减少、转运速度减慢。

5. 药物干预验证
 

外源性补充WNT5a、使用RhoA激活剂CN03或肌动蛋白稳定剂Jasplakinolide，验证了这些干预能有效逆转核膜变形、心律失常、收缩障碍及Cx43分布异常；而使用抑制剂Rhosin则在正常细胞中验证了可模拟EDMD表型。

6. 组织水平验证
 

将iPSC-CMs与水凝胶混合构建三维工程化心肌组织（EHT），在不同拉伸长度和起搏频率下测量收缩力，验证了EDMD组织水平上的收缩力下降及起搏效率降低，且CN03可部分挽救。

7. 动物模型验证
 

构建Lmna L204P敲入小鼠（杂合子存活），通过心脏超声、心电图、离体心肌细胞收缩检测及病理分析，验证了体内心脏功能减退、应激诱发的心律失常及骨骼肌病理改变。

1. 临床特征及EDMD iPSC-CMs的肌节与核膜异常

研究招募了5个LMNA突变相关EDMD家系，鉴定出L204P、R471H等5种突变，患者表现为关节挛缩、肌营养不良及多种心律失常，多个家系有心源性猝死史。通过重编程及小分子分化获得高纯度iPSC-CMs。EDMD iPSC-CMs中肌节结构紊乱比例显著升高、肌节长度增加，LMNA mRNA及lamin A/C蛋白表达降低；同时核膜皱缩和核泡形成比例显著高于对照，表明LMNA突变破坏核膜完整性。

图1 临床特征

2. EDMD iPSC-CMs的心律失常表型及LMNA过表达验证

膜片钳显示EDMD iPSC-CMs中动作电位不规则比例升高、Vmax降低，SCN5A表达及钠电流密度下降。MEA检测显示传导速度变异性和峰间期变异性增大，异丙肾上腺素应激下心律失常进一步加重。在健康iPSC-CMs中过表达突变型LMNA可重现核膜异常和心律失常，而过表达野生型LMNA则能显著挽救EDMD iPSC-CMs的心律失常并改善收缩功能。

图2 EDMD特异性iPSC-CMs呈现核膜变形和心律失常负担增加

3. 多组学分析揭示WNT5A转录抑制及外源WNT5a挽救效应

RNA-seq、ATAC-seq及CUT&Tag整合分析显示，EDMD iPSC-CMs中WNT5A是同时满足转录下调、染色质开放性降低、LMNA结合减少的57个基因之一，且后续验证表明其在EDMD心脏病理中起核心作用。qPCR、Western blot及ELISA证实EDMD iPSC-CMs及患者血清中WNT5A表达显著降低。外源性补充WNT5a可显著减少肌节紊乱和核膜变形，改善心律失常及传导异常。

图3 LMNA变异体与染色质结合减少导致WNT5A染色质开放性和转录水平降低

图4 WNT5a信号失活导致EDMD iPSC-CMs的病理表型

4. WNT5a/RhoA信号失活导致肌动蛋白动力学异常及稳定肌动蛋白的挽救

CytoD洗脱实验显示EDMD iPSC-CMs中F-actin聚合恢复减慢，直接检测证实肌动蛋白聚合减慢、解聚加快，伴随RhoA活性下降及收缩功能障碍（不规则收缩增多、峰值降低）。WNT5a补充或RhoA激活剂CN03可恢复F-actin聚合及收缩功能。使用肌动蛋白稳定剂Jasplakinolide（JAS）同样能恢复F-actin聚合能力，显著降低核膜变形、心律失常及传导异常，并改善收缩功能。

图5 失活的WNT5a/RhoA信号导致EDMD iPSC-CMs中肌动蛋白丝动力学异常

图6 稳定肌动蛋白组装挽救EDMD iPSC-CMs的病理表型

5. 异常肌动蛋白动力学通过损害Cx43转运及分布导致心律失常

总Cx43表达无变化，但细胞膜上Cx43表达与定位显著降低，共聚焦显示Cx43在细胞边界分布弥散。FRAP实验证实EDMD iPSC-CMs中Cx43荧光恢复速度减慢，表明转运受损。WNT5a、JAS或CN03处理均可改善Cx43的边界分布及转运速度，将肌动蛋白异常与心律失常直接联系起来。

图7 异常肌动蛋白丝动力学通过损害Cx43的转运及边界分布导致心律失常

6. 基因校正、工程化心肌组织及动物模型验证

CRISPR-Cas9修复LMNA L204P突变后，基因校正的iPSC-CMs在肌节、核膜、收缩、电生理、WNT5a/RhoA信号、肌动蛋白组装及Cx43分布等方面均恢复正常。EDMD来源的三维工程化心肌组织（EHT）形态松散、收缩力下降、起搏效率低，CN03处理可部分恢复。Lmna L204P杂合敲入小鼠在交感应激下出现心功能减退及心律失常，验证了体内表型。

图8 激活RhoA活性改善EDMD特异性工程化心肌组织的功能

本研究揭示，LMNA突变通过抑制WNT5A转录导致RhoA失活和肌动蛋白动力学异常，进而引发核膜变形、收缩功能障碍、Cx43转运障碍及心律失常。外源性补充WNT5a、激活RhoA或稳定肌动蛋白均可挽救上述表型，基因校正及野生型LMNA过表达同样有效。Lmna L204P敲入小鼠也表现出心脏功能减退。综上，WNT5a/RhoA/肌动蛋白轴是LMNA-EDMD心脏病理的核心机制，靶向该通路具有治疗潜力。