“活”心肌组织切片光标测实验Protocol
实验概要
心肌切片是心血管基础研究的可选样本，相较成年鼠单细胞分离检测或整体心脏检测，活心肌切片能够在接近生理条件下完整保留心肌组织三维结构、细胞间电耦合及生理特性，可精准捕捉电信号与钙瞬变的时空耦合关系。横切（垂直心脏长轴）能清晰呈现心室壁全层结构，可同时观察心外膜（Epi-）、中层（M-）和心内膜（Endo-）细胞的电生理特性，适配跨壁异质性、缺血 / 梗死区域范围等研究；纵切（平行心脏长轴）可保留房室瓣、乳头肌等连续结构，便于观察纵向肌纤维功能及局部病变特征。同时可直接从人类临床样本制备切片，完美弥补传统单细胞检测（失去组织完整性）及动物模型（物种差异大）的局限，解决了转化研究中实验数据与临床实际脱节的核心痛点。
心肌切片动作电位与钙瞬变信号检测在基础层面可阐明心肌电信号传导机制、钙稳态调控规律，明确跨壁异质性的生理意义及离子通道的组织水平功能；联合HE染色、Masson染色可精准定位电生理异常对应的细胞结构损伤，纤维化与心律失常易感性的关联；结合空间组学可进一步挖掘分子机制，精准定位电生理功能异常区域的差异表达基因及蛋白复合物；临床层面可直接利用临床手术残留或活检获取的人类心肌组织开展研究，实现从临床样本到实验数据、再到诊疗指导的闭环转化，指导精准治疗方案制定；药物研发层面可构建更贴近人体生理状态的评价体系，同步检测药物对钙瞬变、动作电位时程、传导速度、离散度等多维度指标的影响、药物的活性与安全性评估，精准预判心脏毒性，弥补传统动物模型的物种差异缺陷，为心血管转化医学研究与药物研发提供不可或缺的技术支撑。
实验目的
应用光标测技术，检测大鼠心肌组织切片的动作电位和钙瞬变信号，分析动作电位时程、动作电位时程离散、传导速度、传导离散度、钙瞬变时程、钙瞬变时程离散、钙传导速度、传导离散度等电生理指标。
实验动物
SD大鼠
实验方法
Protocol
（SD大鼠心肌组织切片光标测实验案例）
一、实验前准备
（一）主要试剂：
台氏液、KH液、Blebbistatin、Rhod-2 AM、RH-237、F127。
（二）主要器材：
切片机刀片、灌流针、眼科剪、眼科镊、显微剪、手术刀、手术剪、止血钳。
（三）主要溶液配方：
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台式液
注：MgCl2▪6H2O 、CaCl2▪2H2O可配制为相应浓度的母液；溶液配好后需经0.22μm孔径滤膜过滤；使用前，提前30 min充纯氧气(100% O2），达到氧饱和。
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KH液的配制
注：KCl、KH2PO4、MgCl2▪6H2O可配制为10×母液；溶液配好后需经0.22μm孔径滤膜过滤；使用前，提前30min充混合氧气（混合氧：95% O2，5% CO2），达到氧饱和。
染色时使用无BDM台氏液或KH液均可，首选KH液，效果比较好。(注意：无BDM台氏液染色使用纯氧气，KH液染色使用混合氧气)
3. 兴奋-收缩解偶联剂Blebbistatin母液，DMSO溶解1mg/mL，分装为100µL/tube， -20℃储存备用。（摩尔质量292g/mol）
4. 制备荧光染料的母液：为避免反复冻融，将染料提前配制并进行分装储存于-20℃。
A：电压敏感染料RH237，DMSO溶解为1mg/mL，分装为100µL/tube；
B：钙指示剂Rhod-2AM，DMSO溶解为1mg/mL，分装为100 µL/tube。
5. 4%低温琼脂糖底座预制
将4g低温琼脂糖溶于100mL蒸馏水中，加热煮沸至沸腾过程无小气泡产生，取适量铺平在适当容器使其液面平整，冷却凝固。
二、大鼠心脏获取与处理
1. 大鼠称重，腹腔注射肝素钠（3125U/kg），15-20min后异氟烷麻醉脱颈处死；
2. 将处死的大鼠置于实验台固定，腹部喷酒精消毒。剪开胸部皮肤，使剑突暴露，用镊子夹起剑突，沿左、右肋中部剪开胸腔，暴露心脏。用镊子夹起肺，提起心脏，沿肺后部快速剪下心脏，并置于含氧（95％O2，5％CO2）灌流液中；
3. 找到主动脉，剪去多余组织；在镊子辅助下迅速将主动脉连接到灌流针上，主动脉夹固定，并用手术缝线（规格4-0）结扎（注：排除气泡）；心脏用KH液逆行灌注，逆行灌注速率调节至10mL/min，使灌注压保持在60-70mmHg；灌流15-20min，排出心脏内残余血液及使心脏恢复正常节律；
4. 待心脏稳定，无残血泵出，循环灌流2号罐中100mL KH液。
三、心脏停跳及荧光染色（全过程均在避光环境下进行）
1. 停跳：在100mL循环KH液中加入300µL Blebbistatin（注：从给药口注射，高浓度停跳），观察Blebbistatin逐渐减少运动伪迹，1-2min左右停跳；
2. 细胞膜打孔：停氧，在罐中加入50μL Pluronic F127（F127 1mL），循环灌流10min；
3. 胞内钙染色：将100μL钙指示剂Rhod-2AM从给药口缓慢注射（注：一定要匀速缓慢注射，3-5min左右，高浓度给药），循环15min；
4. 膜电压染色：将100μL电压敏感染料RH237 加入100mL循环系统，循环15min；
四、制备纵切/横切切片
1. 纵切切片：将负载完染料的心脏移至到KH液中，去除心房和心尖部分组织，剪掉右室壁，在室间隔剪开，打开左室壁，修剪大小合适且平整的左室壁组织块。将修整好的组织块采用组织胶固定在底部托盘的低温琼脂糖底座上（心外膜朝下），待组织胶凝固干燥之后放入负载Blebbistatin和荧光染料(整体心脏浓度1/5)的冰浴台氏液（0-4℃）并持续充氧，进行纵切切片。
2. 横切切片：将负载完染料的心脏移至到KH液中，去除心房和心尖部分组织，将心底部采用组织胶固定在底部托盘上，待组织胶凝固干燥之后首先使用注射器将心室腔充分灌注低温琼脂，随后灌注覆盖整块组织，待低温琼脂凝固之后修剪琼脂至合适大小放入负载Blebbistatin和荧光染料的(整体心脏浓度1/5)冰浴台氏液（0-4℃）并持续充氧，进行横切切片。
表1 心肌切片横切、纵切方式对比
3. 切片厚度：300-400 μm/片，切片机前进速度为0.04-0.05mm/s，振幅为1.0mm，频率80Hz（不同动物切片组织需要根据实际情况可调节设置参数）。
4. 切片在充氧冰浴的台氏液（0-4℃）中充氧恢复1-1.5h。
5. 进行检测前将切片梯度复温至37℃。
五、数据采集与记录
1. 用两个520nm LED灯光激发心肌切片荧光信号，通过光路系统中的二相色镜和不同波长的滤光片分离荧光信号，由两个高速CMOS科研相机分别采集动作电位信号和钙离子信号；
2. 聚焦：设置LED灯2A、4A激发光（5A灯头）聚焦在切片上，调整双摄像机与切片之间的距离，以获得最大分辨率；选择成像区域，采样频率与曝光时间。
3. 记录自发及不同频率刺激下电信号。
图1 不同频率刺激下大鼠心肌切片动作电位波形图、 Active Time（激活时间）、APD90（动作电位复极至90%所需时间）
图2 不同频率刺激下大鼠心肌切片 Active Time（激活时间）、CaT90（钙浓度恢复至90%所需时间）、动作电位波形图
自发下心肌切片（横切）动作电位传导视频
自发下心肌切片（横切）钙信号传导视频
4Hz刺激下心肌切片（纵切）动作电位传导视频
4Hz刺激下心肌切片（纵切）钙信号传导视频
六、注意事项
1、用去离子水冲洗系统（冷-热-冷），使系统保持洁净，并通过调节蠕动泵，使出液口达到相应的灌流速度；
2、KH液使用前需要提前充氧（95% O2+5% CO2）饱和，使灌流液达到氧饱和状态；
3、排出灌流系统内空气，使灌流液充满整个管路；
4、打开循环水加热系统，调节循环水温度，使流出的灌流液温度为37℃左右；
5、在光标测实验过程中，通过灌流系统注射停跳剂和荧光染料时注意避光；
6、通过灌流系统注射停跳剂和荧光染料时，需缓慢匀速注射，防止堵塞冠脉造成心肌梗死；
7、切片时和恢复时注意避光。
