缺血再灌注心律失常的潜在治疗靶点—CX43丝氨酸磷酸化位点

缺血/再灌注（I/R）心律失常是缺血性治疗的严重临床并发症，占心血管疾病致死病例的三分之一，与猝死密切相关。

间隙连接蛋白43（Cx43）是心肌细胞间隙连接通道的核心成分，该蛋白定位于心肌闰盘，维持心肌细胞间的正常电耦合。Cx43羧基末端（CT）存在超过17个可磷酸化位点，其磷酸化状态可介导细胞信号通路，调控Cx43依赖的细胞间通讯、心电稳态及心肌结构完整性。病理状态下，Cx43发生去磷酸化，且会从闰盘重新分布至侧膜，形成异常半通道，破坏细胞间通讯平衡，进而显著增加心律失常风险。其中S282等丝氨酸位点的去磷酸化，已被证实与缺血心肌的心律失常易感性密切相关，但具体调控机制及有效防治策略仍需深入研究。

研究明确，Cx43-S282去磷酸化是缺血 / 再灌注心律失常的关键靶点，同时揭示了小分子化合物LB100的核心干预机制—通过缓解Cx43 环-尾区的分子内相互作用、逆转钙信号异常及后除极现象，为缺血/再灌注心律失常提供全新的治疗思路，也为靶向Cx43磷酸化的抗心律失常药物研发提供重要实验依据与候选化合物。

Cx43-S282位点去磷酸化可通过损害细胞间的间隙连接，增强了半通道通透性，进而诱发缺血/再灌注性心律失常。Cx43第二内环（L2）与羧基末端之间的分子内相互作用增强，这些与致心律失常性相关。LB100通过恢复Cx43-S282磷酸化，有效抑制心律失常，这为保护心脏免受缺血/再灌注性心律失常提供一种新颖且可靶向的作用机制。

1. LB100可有效调控大鼠Cx43-S282位点去磷酸化，并抑制缺血/再灌注心律失常的发生

本研究改良了心肌缺血-再灌注（I/R）方案（缺血15分钟/再灌注45分钟），使室性心动过速（发生率71.4%）和心室颤动（发生率 28.6%）的发生率大幅提升，效果优于传统模型。该改良模型无明显梗死，但心肌损伤相关指标存在异常；LB100与维拉帕米预处理均能减轻该损伤，且LB100对再灌注心律失常的抑制效果更全面。Western blotting实验表明，I/R会改变Cx43磷酸化模式并增强蛋白磷酸酶2A（PP2A）活性；LB100可通过促进蛋白磷酸酶2A的催化亚基C（PP2A-C）磷酸化抑制其活性，维持Cx43-S282磷酸化水平，这可能是其抗心律失常的关键机制。

图1 LB100对I/R诱导大鼠心室心律失常及Cx43 S282位点去磷酸化的影响

2. Cx43-S282A基因转染可诱导心肌细胞发生细胞间通讯解耦联及钙瞬变
 

为明确磷酸化水平下调的Cx43-pS282是否参与缺血再灌注（I/R）后室性心律失常的发生，研究开展体内外实验。体内给大鼠心肌注射Cx43-S282非磷酸化突变体（S282A）基因，结果与I/R效应一致，引发局部心肌损伤及室性心律失常（Xue等，2019）。体外转染新生大鼠心室肌细胞22小时后，相较野生型，6-羧基荧光素扩散及同步钙瞬变均受显著抑制。

3. 合并室性心律失常的心力衰竭患者心肌中Cx43-S282位点的去磷酸化特征
 

为探究人类心肌损伤相关性心律失常是否存在与大鼠模型相似的Cx43变化，本研究采集了8例心衰移植患者的心室组织样本，将其分为重度心肌损伤伴心律失常组（4例，含室性早搏、室性心动过速患者，其CK-MB水平显著升高）与无心律失常对照组（4例，其CK-MB 水平正常）。

对比发现，心律失常组患者心肌Cx43-S279、S282及S368位点磷酸化水平显著降低，且两组在心脏功能、关键离子通道表达等指标上无差异，提示Cx43相关位点去磷酸化与人心衰合并室性心律失常密切相关。

图2 心力衰竭患者心肌组织中Cx43蛋白S279/282、S262及S368位点的磷酸化水平

4. Cx43-S282基因敲入小鼠可自发出现室性心律失常，且对LB100治疗敏感

为明确Cx43-S282位点低磷酸化是否与I/R心律失常相关，研究人员构建该位点突变的基因敲入小鼠。这类小鼠的出生率和存活率有所下降，存活的成年小鼠心脏基本正常，但约67.7%会出现室性早搏、房室传导阻滞等心律失常，离体心脏实验也验证了这一现象。

研究将小鼠分为有无心律失常（S282A/+、S282A/+-Arr.组）两组，发现心律失常组（S282A/+-Arr.组）小鼠有典型的电生理异常，异丙肾上腺素会加重其症状；进一步检测显示，S282A/+-Arr.组小鼠心肌中Cx43的S279/S282位点磷酸化水平降低，且这种变化仅发生在心脏，其他组织无此现象。最终证实，Cx43-S282位点磷酸化水平越低，室性心律失常发生率越高，该位点去磷酸化与心律失常密切相关。

图3 Cx43-S282A/+小鼠离体心脏的电传导特性变化

鉴于LB100可促PP2A-C及Cx43-S282磷酸化、抑制I/R心律失常，本研究进一步探究其对相关心律失常的改善效果，结果显示LB100以剂量依赖性降低小鼠室性早搏（PVB）和房室传导阻滞（AVB）发生率，改善心动过缓、缩短延长的PR间期与QRS波，还能增强PP2A-C磷酸化并恢复Cx43-S282磷酸化水平，其抑制PVB效果优于1.0mg/kg 维拉帕米（后者仅抑制30%）。

图4 LB100对S282A/+-Arr. 小鼠心律失常及S282位点低磷酸化的作用

5. 在S282A/+心律失常小鼠心脏中发生间隙连接重构

大鼠I/R心脏的心肌侧膜出现明显的蛋白分布异常；基于此，本研究进一步探究S282A/+小鼠心肌组织中是否存在Cx43重构现象。结果显示，与大鼠缺血 - 再灌注模型的表现一致，S282A/+-Arr.小鼠心肌细胞侧膜同样出现Cx43分布异常；且该小鼠心室组织的细胞膜组分及连接区组分中，Cx43含量显著高于野生型小鼠，进一步佐证了这一现象。

图5 S282A/+-Arr.小鼠心室组织中Cx43的定位异常

6. 早发钙瞬变与S282A/+小鼠的致心律失常性密切相关

为探究Cx43-S282位点低磷酸化相关致心律失常性的电生理机制，采用电标测技术检测，结果显示：S282A/+-Arr.小鼠中，分别有59.4% 出现部分或完全传导阻滞，25.0%存在异位触发灶。与之相符的是，与野生型小鼠左心室相比，S282A/+-Arr.小鼠心室中间隙连接通透染料扩散受限；提前用LB100预处理可恢复其正常电传导与细胞间物质扩散。

图6  LB100可改善离体S282A/+-Arr.小鼠心脏中的电传导异常

光学标测显示，窦性心律下的S282A/+-Arr.小鼠左心室钙信号扩散减慢且节律紊乱，早发钙瞬变、钙振荡发生率分别达45.0%、27.0%。尽管钙信号达峰时间、APD90等指标无变化，但膜电位检测发现其心室电传导速度显著减慢，EADs/DADs、折返发生率分别升至 73.0%、18.2%，且钙活动异常与电位异常呈同步关联。

选择性半通道抑制剂Gap19可改善再灌注性及心肌病相关心律失常，本研究证实LB100与Gap19均可逆转S282A/+-Arr.小鼠心室的电活动和钙信号异常，抑制EADs/DADs的发生。

图7 LB100对离体S282A/+-Arr.小鼠心脏中钙信号紊乱及动作电位异常的作用

7. Cx43-S282位点的去磷酸化作用，会影响其SH3结构域对Cx43分子内环/羧基末端相互作用的调控功能

I/R大鼠与S282A/+小鼠心肌细胞膜上的Cx43半通道分布增多，这可能是Cx43-S282位点相关修饰引发早发钙瞬变与后除极的核心机制。S279/S282位点位于Cx43羧基末端SH3结合域，可结合Cx43的第二内环（Cx43-L2）并增强分子内相互作用，该过程可被Gap19抑制。本研究推测S282去磷酸化影响SH3与L2结合，经HeLa细胞转染实验、两种检测方案及动物离体心肌细胞验证，结果证实S282A突变组的半通道活性更强，且LB100可逆转相关结合增强及半通道开放异常，最终表明，S282去磷酸化可通过增强SH3与L2的结合，促进半通道开放。

图8 去磷酸化的Cx43-S282位点可影响其SH3结合域对Cx43分子内环/羧基末端间相互作用的调控功能